在疫情期間我們總是能看見這樣的報道，“病毒核酸檢測出現(xiàn)“假陰性”？”“新冠病毒核酸檢測出現(xiàn)假陰性 到底是什么影響了準確率？”“為何新冠病毒核酸檢測不斷出現(xiàn)假陰性？”。然而在平時的PCR實驗室卻經(jīng)常出現(xiàn)“假陽性”的現(xiàn)象。PCR實驗室總是出現(xiàn)假陽性，明明沒有加模板最后卻擴出了產(chǎn)物。如果這種現(xiàn)象頻頻出現(xiàn)，就要注意一下操作環(huán)境了。這里涉及一個氣溶膠的概念，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，能在空氣中滯留至少幾個小時。PCR反應過程中不斷進行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，PCR管中空氣的部分形成了氣溶膠，攜帶了大量DNA擴增產(chǎn)物（注意1ng擴增產(chǎn)物中可作為模板的DNA片段的數(shù)量超過1ng起始模板中可擴增DNA片段數(shù)量的幾百萬倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個bp，要擴增的單拷貝基因片段是300bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬分之一）。如果在實驗室打開含PCR擴增產(chǎn)物的管蓋，大量攜帶DNA擴增產(chǎn)物的氣溶膠就會涌出，擴散到空氣中，從而對環(huán)境造成污染。雖然在整個空間環(huán)境中DNA的含量很低，但是由于理論上只要有1個可做為模板的DNA片段也能PCR擴增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。所以在專業(yè)的PCR實驗室（比如臨床PCR檢驗實驗室）室通常有四區(qū)隔離（或至少是三區(qū)隔離）的要求。
1、試劑配制區(qū)：PCR反應體系的配制區(qū)域。 2、標本處理區(qū)：包括擴增模板的制備，也就是我們常常提取DNA的地方；3、PCR擴增和產(chǎn)物分析區(qū)：進行PCR擴增的區(qū)域，也是擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析的區(qū)域。
如果將PCR擴增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)再次分開，就是四區(qū)隔離了。四區(qū)隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個PCR區(qū)域之間的流動—最好的方法是干脆每個區(qū)域隔一幢樓，那肯定是最佳的隔離措施了，但操作起來肯定不現(xiàn)實，于是便有了針對不同區(qū)域設置正負壓的方法： 試劑配制區(qū)（Ⅰ區(qū)）：最潔凈的區(qū)域，保持微正壓使得外界空氣無法進入隔離污染源。并且陰性模板應該在此區(qū)加入PCR管并蓋蓋，嚴禁在此區(qū)域打開、存放裝有DNA模板的離心管；DNA模板添加區(qū)（Ⅱ區(qū)）：保持微負壓，保證內(nèi)部空氣不外泄，以免陽性模板的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染；擴增及PCR產(chǎn)物分析區(qū)（Ⅲ區(qū)）：保持微負壓，使得內(nèi)部空氣不外泄，以免擴增產(chǎn)物的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。操作時遵循Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)單一方向進行，不可逆向進行。
對于科研用途的PCR實驗室，如果無法達到嚴格的三區(qū)隔離的要求，至少也要做到兩區(qū)隔離：即正壓區(qū)和負壓區(qū)。正壓區(qū)實施Ⅰ區(qū)的功能，負壓區(qū)實施Ⅱ區(qū)，Ⅲ區(qū)的功能。最忌諱也是最可怕的是反過來，在正壓區(qū)實施Ⅲ區(qū)的功能。我們有個用戶的所有實驗室都是正壓—因為進入實驗室的空氣都是經(jīng)過過濾的。他信心滿滿地認為他們的實驗室超干凈，做PCR絕對沒問題，但他們實驗室出現(xiàn)了最嚴重的PCR產(chǎn)物污染問題—所有的陰性對照都是陽性。所以PCR實驗室的潔凈度是次要的，不同區(qū)域間的空氣是互相之間否有流通才是最關鍵的。
如果有的小伙伴問，我們的實驗室沒有正負壓的區(qū)分，或者是全負壓，全正壓怎么辦呢？那我們的建議是：別怕麻煩，找個遠離Ⅲ區(qū)（通俗地講就是打開PCR擴增產(chǎn)物的蓋子區(qū)域，比如電泳區(qū)）的實驗室當做PCR I區(qū)使用，能省掉后續(xù)更多的麻煩。
既然PCR三區(qū)隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請注意以下細節(jié)，思考一下氣溶膠來自哪里：1. 每個區(qū)域都應配備專用的移液器，不可交叉混用。我們的一位用戶拿電2. 每個區(qū)域都應配備專用的移液器吸頭，不可交叉混用。 3. 如果條件允許，在PCRⅢ區(qū)工作結束后再次進入PCR I區(qū)需要更換實驗4. 在PCR I區(qū)、PCRⅡ區(qū)配備帶濾芯吸頭。
很多做PCR的小伙伴會將做PCR的吸頭滅菌、或者是在超凈實驗臺做PCR操作。但在實驗臺看來這完全沒有必要，因為做好PCR最重要的是防止擴增產(chǎn)物的污染，而不是無菌操作！試想一下，高壓滅菌了又如何，DNA并不會因此而降解多少，如果細菌的DNA會參與PCR擴增，那么無論活菌或是細菌尸體都一樣能擴增出DNA條帶。
